常規普通PCR常見(jiàn)問(wèn)題

更新時(shí)間：2022-07-04瀏覽：1520次

1.瓊脂糖凝膠電泳后無(wú)PCR擴增產(chǎn)物條帶

主要表現：Marker及對照條帶均正常，但檢測樣本無(wú)條帶。

原因分析：1.反應條件不合適：PCR過(guò)程中退火溫度過(guò)高，退火延伸時(shí)間不足，反應循環(huán)數過(guò)少。

2.核酸模板濃度或純度低：普通PCR的檢測敏感度有限，樣本核酸含量低或者含有抑制物。

3.反應體系與核酸擴增不匹配：檢測體系中的Mg2+濃度，dNTPs量或Buffer與目標核酸擴增所需條件不匹配。

4.引物設計不當或者發(fā)生降解：存在引物二聚體或二級結構，引物稀釋后未分裝儲存條件不適宜或者反復凍融次數過(guò)多。

解決方案：1.優(yōu)化反應條件，梯度摸索退火溫度，延長(cháng)退火延伸時(shí)間，增加反應循環(huán)數（30-45區間為宜）。

2.對核酸模板進(jìn)行純化，或使用商業(yè)化核酸提取試劑盒進(jìn)行提取，增加核酸模板的上樣量。

3.優(yōu)化反應體系（預混體系除外），改變檢測體系中的Mg2+濃度及dNTPs用量，更換體系中Buffer。

4.重新設計引物，避免引物二聚體和鏈內二級結構，在一次稀釋引物后可分裝成多支小管，減少反復凍融次數。

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